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        GT115 Electro

        文字:[大][中][小] 2018-3-27    浏览次数:2347    

        GT115 Electroporation-Competent Cell 产品说明书




        产品规格(CAT#: DE1090)

        GT115 Electroporation-Competent Cell                50μl/支

        pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

        保存条件(保质期):                                         -80℃(6个月)


        基因型

        F- mcrA?(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15?lacX74 recA1 rpsL (StrR) endA1 ?dcm uidA(DMluI)::pir-116?sbcC-sbcD


        产品说明

        GT115菌株,是专门用来克隆含有发夹结构(Hairpin)或重复序列等DNA二级结构的基因序列的大肠杆菌菌株。大肠杆菌中存在一种SbcCD蛋白复合体,可以识别DNA发夹结构,并将其切除;将sbcC和sbcD两个基因突变,增强了发夹结构DNA的稳定性。同时在大肠杆菌基因组中引入uidA(DMluI)::pir-116,使GT115可以表达 兀 蛋白,含有R6Kg ori复制子的质粒( pCpG-mcs、pCpG-LacZ、pCpG-siRNA …)可以正常复制。rpsL赋予GT115链霉素抗性,同时该菌株还含有核酸酶 (endA)突变、重组酶 (recA)突变,增强了外源DNA的稳定性。唯地生物生产的GT115电击感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率可达1×1010 cfu/μg DNA。


        操作方法

        1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。

        2. 取-80℃保存的GT115电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。

               A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19;

               B. 对于连接产物,大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与GT115电击感受态混合后电击转化,                  无需进行DNA纯化,但DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过5 μl/50 μl感受态。

               C. 对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                  EDTA)重悬,然后与GT115电击感受态混合进行电击转化。

        3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。

        4. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。

        5. 2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50 ml离心管(BD Falcon 50 ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃,225 rpm复苏60分钟。

        6. 5000 rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。

         

        S.O.C 培养基配方

        2% Tryptone

        0.5% Yeast Extract

        10 mM NaCl

        2.5 mM KCl

        10 mM MgCl2

        10 mM MgSO4

        20 mM glucose

        PH-7.0


        S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 


        注意事项

        1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

        2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。

        3. 当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。

        4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

        5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

        6. 对于连接产物转化,部分公司的连接体系或重组体系(例如:Thermo,NEB公司的T4 连接酶系统,NEB,天根的50度反应重组系统)可以直接与EPI300电击感受态混合后电击转化,无需纯化,但DNA浓度不能过高,最好不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。

        7. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

        8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。




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