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        DH10B Electro

        文字:[大][中][小] 2015-9-1    浏览次数:4629    

        DH10B Electroporation-Competent Cell产品说明书





        产品规格(CAT#: DE1070)

        DH10B Electroporation-Competent Cell                50μl/支

        pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

        保存条件(保质期):                                         -80℃(6个月)



        基因型

        F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ?80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galE15 galK λ-rpsL nupG

         

        产品说明

        DH10B电击感受态细胞只能用于电击转化,不能用于热激转化。DH10B菌株来源于MC1061菌株,mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10B菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (无论真核生物还是原核生物的基因组DNA都能被高效的转入DH10B中)。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。φ80dlacZ?M15标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选,rpsL赋予其链霉素抗性。 DH10B感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种文库构建,经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率>1010 cfu/μg DNA。


        操作方法

        1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。

        2. -80℃保存的DH10B电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。

        A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19;

        B. 对于连接产物,请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重悬,DNA浓度不超过100ng/μl,体积不超过5μl/50μl 感受态。

        3. 200 μl枪头将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。

        4. 启动电转仪,设置参数:C=25 μFPC=200 ΩV=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。

        5. 2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50ml离心管(BD Falcon50ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C. 培养基至5ml37℃,225 rpm复苏60分钟。

        6. 5000rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。


        S.O.C 培养基配方

        2% Tryptone

        0.5% Yeast Extract

        10 mM NaCl

        2.5 mM KCl

        10 mM MgCl2

        10 mM MgSO4

        20 mM glucose

        PH-7.0

        S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

         

        注意事项

        1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10

        2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。

        3. DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。

        4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

        5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

        6. 对于连接产物转化,最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物,保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。

        7. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头 (普通200ul枪头应剪去枪头尖0.6cm) 避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

        8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。





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        DH10B Electroporation-Competent Cell产品说明书


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